تصویربرداری میکروسکوپی مغز بدون برش: میکروسکوپ ExA-SPIM
مغز پستانداران یک سیستم چند مقیاسی است. مدارهای عصبی یک بزرگراه اطلاعاتی را تشکیل می دهند که با انشعاباتی که به طور بالقوه ده ها سانتی متر در داخل مغز کشیده می شوند. اما این اتصالات فقط چند صد نانومتر ضخامت دارند – تقریباً یک هزارم عرض موی انسان.
درک اینکه چگونه مغز سیگنال ها را رمزگذاری و ارسال می کند، مستلزم همسویی وقایع در هر دو این مقیاس است. به طور متعارف، محققان مغز با استفاده از یک فرآیند چند مرحله‌ای با این مشکل مقابله کرده‌اند: بافت را به بخش‌های نازک برش می‌دهند، هر بخش را با وضوح بالا به تصویر می‌کشند، لایه‌ها را دوباره به هم می‌چسبانند و مسیرهای تک تک نورون‌ها را بازسازی می‌کنند.
ژوهائو وو، عصب‌شناس در ویل کورنل در شهر نیویورک، این مرحله آخر را «مثل ردیابی سیم تلفن در منهتن» توصیف می‌کند. در واقع، او می افزاید، “حتی پیچیده تر هم است، زیرا هر نورون هزاران، اگر نه ده ها هزار، اتصال ایجاد می کند”.
محدودیت های میکروسکوپ و فائق آمدن بر آن
سازندگان میکروسکوپ به دنبال این بوده اند که به محققان اجازه دهند تا با زاویه باز به یک تکه بزرگ از بافت نگاه کنند و همچنان جزئیات را از نزدیک ببینند، بدون اینکه ابتدا بافت را برش دهند و سپس آکسون ها را در بخش های مختلف بازسازی کنند. چالش این است که اهداف میکروسکوپ عموما به گونه ای طراحی شده اند که گرفتن تصاویر با وضوح بالا از نمونه های بزرگ دشوار است.
ExA-SPIM
پیش چاپ مقاله ای منتشر شده در ماه ژوئن یک راه حل ارائه می دهد. ابتدا محققان لیپیدها را به روش شیمیایی حذف کردند تا بافت شفاف شود. سپس بافت را در ماده‌ای به نام هیدروژل که آب را جذب می‌کند جاسازی کردند تا بافت را تا سه برابر حجم اولیه خود گسترش دهند. در نهایت، آنها آن را با یک لنز قرض گرفته شده از یک حوزه علمی کاملاً متفاوت اسکن کردند. به این ترتیب، تصویربرداری از کل مغز موش بدون نیاز به برش امکان پذیر بود. با وضوح حدود ۳۰۰ نانومتر در صفحه و ۸۰۰ نانومتر به صورت محوری (عمود بر صفحه)، قابل مقایسه با میکروسکوپ کانفوکال، تکنیکی که به طور گسترده برای تصویربرداری از مغز با وضوح بالا استفاده می شود. این پروتکل که ExA-SPIM (میکروسکوپ روشنایی انتخابی صفحه به کمک گسترش) نامیده می شود، برای تصویربرداری از نورون ها در مغز ماکاک و انسان نیز استفاده می شود.
جایارم چاندراشکار، عصب شناس در موسسه آلن در حوزه دینامیک عصبی در سیاتل، واشنگتن، می گوید: «چیزی که چنین سیستمی به ارمغان می آورد ترکیبی از توانایی تصویربرداری از حجم بسیار بزرگ [بافت مغز] با وضوح بسیار خوب است.»
چاندراشکار می‌گوید: این رویکرد می‌تواند کل مغز موش را در کمتر از یک روز تصویر کند – بسیار سریع‌تر و با وضوح بالاتر نسبت به سایر روش‌های تصویربرداری کل مغز ، مانند MouseLight و fMost. و این واقعیت که تصاویر فقط به بازسازی محاسباتی محدودی نیاز دارند، دقت داده های حاصل را به طور قابل توجهی افزایش می دهد.
دکتر وو خاطرنشان می کند که هیچ یک از اجزای سیستم جدید نیستند – آنها فقط به روش هم افزایی مونتاژ شده اند. او می‌گوید: «این اولین تلاش برای انجام این کار نیست، اما احتمالاً بهترین تلاشی است که تاکنون نتیجه داده است.»
قدم هایی که برای این پیشرفت برداشته شده بود
اولین عنصر پروتکل – پاکسازی و گسترش بافت – برای چندین دهه استفاده شده است، اما معمولاً در قطعات کوچکتر بافت. گلیزر می‌گوید این تیم باید این روش را بهینه می‌کرد تا مطمئن شود که نمونه‌های مغز به صورت همسانگرد منبسط می‌شوند – یعنی به یک میزان در همه جهات.
گلیزر می گوید نکته کلیدی روش جدید لنز آن است. در انتخاب آن، آنها به صنایع بینایی ماشین و اندازه‌شناسی نگاه کردند و روی یکی از مواردی که معمولاً برای شناسایی عیوب به اندازه پیکسل در نمایشگرهای صفحه تخت و سایر دستگاه‌های الکترونیکی در حین حرکت در امتداد تسمه نقاله استفاده می‌شود، استفاده کردند. او می‌گوید که لنز میدان دید بزرگ‌تری نسبت به لنزهایی دارد که معمولاً در علوم زیستی استفاده می‌شوند، و چون بافت قبل از تصویربرداری منبسط می‌شود، وضوح یک میکرومتری برای ردیابی آکسون در کل مغز کافی است.
محققان آن لنز را در میکروسکوپی ساختند که ساختارهای سه بعدی را به صورت مجموعه ای از صفحات دو بعدی تصویر می کند، تکنیکی به نام روشنایی صفحه انتخابی. آنها سپس دوربینی را اضافه کردند – که آن نیز از صنایع بینایی ماشین و اندازه‌شناسی گرفته شده است – که ۳۸ برابر بیشتر از دوربین‌های معمولی در علوم زیستی استفاده می‌شود و می‌تواند میدان دیدی با ابعاد ۱۰.۶ × ۸.۰ میلی‌متر را ثبت کند. چاندراشکار می‌گوید با این مشخصات، یک صفحه ۲ بعدی از مغز موش منبسط شده را می‌توان در حدود ۱۵ کاشی در مقایسه با ۴۰۰ کاشی در یک میکروسکوپ معمولی ثبت کرد.
میکروسکوپ قدرتمند پروتئین های موتور را با جزئیات بی سابقه ای به تصویر می کشد
فلاوی لاووی کاردینال، عصب شناس و میکروسکوپیست در دانشگاه لاوال در شهر کبک کانادا، می گوید: «دوست داشتم که آنها خارج از چارچوب فکر می کردند و به سایر زمینه های علم نگاه می کردند.» او می افزاید: «این بسیار بهتر از رویکردهایی است که شامل لنزهای سفارشی شده است که باعث می شود این سیستم برای سایر محققان کمتر در دسترس باشد.»
کاترین ویلیگ، میکروسکوپیست در دانشگاه جورج آگوست گوتینگن آلمان می‌گوید «ExA-SPIM قطعاً مورد توجه است»، به‌ویژه برای مطالعات مربوط به اتصالات مغز یا «کانکتومیکس». اما او می افزاید، «خوب است که وضوح تصویر را کمی بیشتر کنیم تا بتوانیم به وضوح خارهای دندریتیک را ببینیم.»
داده هایی که تاکنون با این روش به دست آمده اند
به گفته گلاسر، یک مغز منفرد را می توان در کمتر از یک روز تصویربرداری کرد. این تیم تاکنون از بیش از ۲۵ مغز موش تصویربرداری کرده است که حدود ۲.۵ پتابایت داده تولید می کند که این تیم آن را ۵ برابر فشرده کرده و در فضای ابری ذخیره می کند. برای تجزیه و تحلیل داده ها، محققان با گوگل همکاری می کنند، که الگوریتم های یادگیری ماشینی را برای پردازش داده ها و بازسازی تصاویر نورون ها ارائه می دهد.
هاری شراف، میکروسکوپیست در پردیس تحقیقاتی جانلیا در اشبرن ویرجینیا، می‌گوید که مقدار داده‌های درگیر می‌تواند مانعی قابل توجه برای کاربران احتمالی این روش باشد. او می‌گوید جدا از چالش تجزیه و تحلیل این حجم از داده‌ها، انتقال آن از میکروسکوپ به کامپیوتر یک چالش بزرگ است. او می‌گوید: «کنسرسیوم‌ها از آزمایشگاه‌ها یا مؤسسات می‌توانند روی مردم، نیرو یا زیرساخت‌ها برای انجام این کار سرمایه‌گذاری کنند، اما رسیدگی به این امر بی‌اهمیت نیست».
آینده میکروسکوپ های هوشمند
همانطور که گفته شد، طراحی میکروسکوپ اوپن سورس است و دستورالعمل های ساخت آن در GitHub موجود است. اما گلیزر می گوید که نسخه فعلی نمونه اولیه ای است که او قصد دارد در سال آینده آن را ساده و مستند کند. او می‌گوید: «مونتاژ آن زمان می‌برد و ساختن آن خیلی آسان نیست. تاکنون چندین آزمایشگاه ابراز علاقه کرده‌اند، اما هیچ‌کدام راه‌اندازی سیستم را امتحان نکرده‌اند. ما می‌خواهیم میکروسکوپ را بازطراحی و مهندسی مجدد کنیم و آن را به‌خوبی مستند کنیم – و امیدواریم حتی بودجه‌ای برای انتشار این سیستم دریافت کنیم تا سایر گروه‌ها بتوانند آن را اتخاذ کنند.»
چاندراشکار می‌گوید ردیابی اتصالات عصبی دوربرد واضح‌ترین کاربرد است و این همان چیزی است که محققان در حال حاضر به دنبال آن هستند. اما آنها همچنین در حال کار مجدد بر روی پروتکل‌های پاکسازی و گسترش هستند تا مولکول‌های زیستی مانند RNA و پروتئین‌ها را دست نخورده نگه دارند و اجازه دهند آنها نیز موقعیت یابی شوند.
دکتر وو می گوید: «من مشتاقانه منتظرم تا ببینم چگونه سایر مشکلات عمومی علوم اعصاب نیز می توانند از این فناوری بهره ببرند.»
منابع
گلیزر، A. و همکاران. پیش چاپ در bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.06.08.544277 (2023).
